Analisis Keragaman Plasmanutfah Apel (Malus pumila Mill) dengan Primer Inter-Simple Sequence Repeat Polymerase Chain Reaction

[cml_media_alt id='1203']Apel manalagi Balitjestro[/cml_media_alt]ABSTRAK. Metode konvensional untuk identifikasi kultivar didasarkan pada deskripsi vegetatif pohon dan karakteristik buah. Teknik ini membutuhkan waktu dan terjadi penyimpangan karakter akibat variasi lingkungan yang mempengaruhi ekspresi karakter. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi 10 varietas apel dari kebun koleksi plasmanutfah dengan menggunakan penanda molekular berbasis mikrosatelit. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika,  mulai bulan Juli 2006 – Desember 2006. Sebanyak 8 primer ISSR digunakan untuk mengamplifikasi sampel DNA. Dari 8 primer yang dicoba 3 primer menunjukkan polimorfis. Dari ketiga primer tersebut diperoleh 260 alel yang 139 diantaranya (53.46%) polimorfis di dalam 29 lokus. Primer-primer tersebut mampu mendeteksi 45-100 persen kemiripan diantara plasmanutfah. Disimpulkan bahwa primer ISSR ini telah mampu dengan baik mengidentifikasi keragaman genetik diantara plasmanutfah apel yang diuji.

Kata kunci: apel, keragaman genetik, ISSR

Apel (Malus pumila Mill) telah dibudidayakan selama berabad-abad dan menjadi salah satu spesies tanaman buah penting di dunia. Meskipun demikian penelitian genetik dan pemuliaan selalu dibatasi oleh siklus regenerasi yang lama, ruang, waktu dan biaya yang diperlukan dalam skreening dan pemeliharaan populasi, jumlah komosom yang besar (2n=34) dan sifat reproduksi outbreeding yang dimilikinya (Maliepaard et al., 1998).

Kesulitan dalam identifikasi kultivar apel yang ekonomis dan cepat sudah menjadi masalah umum pada industri apel. Identifikasi sederhana yang dapat mendefinisikan identitas apel dapat menjawab pertanyaan variasi yang terjadi dalam perbanyakan vegetatif, perubahan bibit dari pohon induknya dan memantapkan kerangka registrasi kultivar baru. Metode konvensional identifikasi kultivar didasarkan pada deskripsi vegetatif pohon dan buah, yang membutuhkan waktu dan terjadi penyimpangan karakter akibat variasi lingkungan yang mempengaruhi ekspresi karakter. Karena hampir semua apel dari kultivar yang sama berasal dari ancestor tunggal melalui pembiakan vegetatif, analisis polimorfisme sekuen DNA harus mampu memproduksi pola pita yang selalu ada diantara anggota dalam satu kultivar tetapi berbeda diantara kultivar-kultivar (Guilford et al., 1997).

Untuk pengelolaan plasmanutfah apel yang paling effisien dan penggunaan yang efektif, koleksi plasmanutfah harus terkarakterisasi dengan baik. Untuk meningkatkan pemanfaatan koleksi yang ada, informasi lokasi gen-gen yang bermanfaat di dalam koleksi atau genom harus pula terdokumentasi dengan baik dan segera tersedia. Karakterisasi koleksi plasma nutfah telah dilakukan pada berbagai level, mulai dari deskripsi taksonomi (Hilu, 1989), biogeografi (Lyman, 1984) dan karakter morfologi dan agronomi (Chapman, 1989) hingga analisis biokimia dan sifat-sifat molekular dan marker (Gepts, 1990). Kebutuhan alat untuk studi genetik telah menstimulasi keingintahuan dalam genetika molekular, karena penanda molekular menyediakan alat untuk mendeteksi gen-gen untuk sifat-sifat penting dan seleksi awal sifat-sifat tersebut dalam program pemuliaan (Maliepaard et al., 1998).

Penemuan penanda molekular berbasis polymerase chain reaction (PCR), seperti randomly amplified polymorphic DNA (RAPDs), simple sequence repeats (SSRs), dan amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) telah menciptakan peluang untuk melakukan karakterisasi koleksi plasma nutfah pada level genetik yang semula tidak mungkin dilakukan. Karena penanda molekular berbasis PCR bersifat polimorfism tinggi, sederhana, dan mampu menghasilkan banyak data dalam periode pendek, maka variasi genetik tanaman yang dideteksi oleh penanda molekular ini semakin bertambah yang memungkinkan pengelola plasmanutfah, pemulia dan pakar genetik melakukan analisis dan identifikasi pada aplikasi yang lebih luas (Hokanson, et al., 1998).

Berbagai tipe penanda DNA telah digunakan dalam studi genetik apel. Penanda biokimia seperti isozim lebih konsisten tetapi tidak cukup informatif untuk aplikasi secara luas. Perkembangan penanda DNA menyediakan informasi polimorfisme yang cukup untuk prosedur identifikasi kultivar yang cepat sekaligus dapat membangun map genetik (Maliepaard et al., 1998).

Restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) telah berhasil digunakan untuk identifikasi kultivar apel dan analisis tetua (Nybom and Schaal 1990). Seperti umum diketahui, teknik ini menghabiskan banyak waktu dan tenaga, sehingga perannya segera tergantikan oleh penanda RAPD (Koller et al. 1993; Mulcahy et al. 1993). RAPDs lebih efisien dalam waktu dan biaya tetapi kadang sulit untuk mengartikan data pita DNA karena sifat dominan, jumlah dan pola pita DNA yang dihasilkan bervariasi dan kompleks (Lavi et al. 1994). Penemuan penanda berbasis simple-sequence repeats (microsatellites) telah memungkinkan pelaksanaan prosedur identifikasi yang lebih efisien dan mudah untuk memperoleh sidik jari (fingerprinting) kultivar apel karena sifatnya yang dapat diulang, pola pita DNA relatif sederhana dan sedikit serta bersifat ko-dominan (Guilford et al., 1997).

Aplikasi penanda DNA yang ko-dominan dan multi-alelik seperti SSR untuk analisis spesies heterozigous tinggi sangat penting karena memungkinkan setiap individu dideteksi secara spesifik (Powell et al., 1996).  Hal ini sangat penting untuk identifikasi genetik unik kultivar, menentukan hubungan kekerabatan antar asesi, menguji keragaman genetik dalam koleksi dan menambah karakterisasi genetik koleksi plasmanutfah dan populasi alam, memungkinkan konservasi sumber daya genetik tanaman menjadi efektif (Gianfranceschi et al., 1998; Hokanson, et al., 1998).

Teknik inter-simple sequence repeat polymerase chain reaction (ISSR-PCR) menggunakan primer tunggal yang memiliki sekuen  mikrosatelit  dan terletak pada salah satu ujung rantai 5’ atau 3’ dengan 1-3 basa oligonukleotida (Zietkiewicz et al., 1994). Sekuen oligonukleotida ini akan menjamin bahwa primer hanya akan terikat pada satu ujung lokus SSR. Sejumlah besar amplikon dapat dihasilkan dari daerah antar SSR, seperti halnya penyebaran SSR yang bervariasi. Sebagai akibatnya, pola pita DNA yang kompleks yang diperoleh dari PCR akan sangat bervariasi diantara genotipe-genotipe dalam satu spesies (Scarano et al., 2002). ISSR ini sangat sederhana sehingga mudah untuk dilakukan, cepat, membutuhkan kuantitas cetakan DNA rendah (10-30 bp), dapat diulang meski pola pita DNA-nya kompleks, tanpa memerlukan informasi awal sekuen DNA untuk disain primer.  Individu-individu yang memiliki kekerabatan yang sangat dekat bisa dibedakan dengan cepat (Zietkiewicz et al., 1994). Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh keragaman plasmanutfah apel berdasarkan penanda DNA berbasis mikrosatelit. Sebanyak 10 varietas komersial apel akan dianalisis keragaman genetiknya berdasarkan primer-primer ISSR.

BAHAN DAN METODE

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika, Tlekung, Jawa Timur. Mulai bulan Juli 2006 – Desember 2006. Sebanyak 10 tanaman apel dari koleksi Kebun Percobaan Tlekung (± 950 m. dpl) telah digunakan sebagai sample, yaitu Princess Nobel, Rome Beauty, Manalagi, Grany Smith, Mutzu I, Anna, Osako, Huang Lin, Summerdel dan  Imperial Gala. Daun muda apel yang berumur 5-10 hari dan membuka sempurna diambil dari lapang dan segera diekstrak di laboratorium.

Ekstraksi, Isolasi dan Kuantifikasi DNA. Daun digerus di dalam nitrogen cair. Tepung daun dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 1,5 ml hingga mencapai volume 300 µL. Sebanyak 700 µL buffer ekstrak (0,05M EDTA, 0,1 M Tris, 1,25% SDS) yang sudah dipanaskan pada suhu 60°C ditambahkan ke dalam sampel daun dan diinkubasi dalam waterbath bersuhu 60°C selama 30 menit. Sampel dipindahkan ke dalam refrigerator bersuhu 4°C selama 15 menit dan ditambahkan 300 µL 6M ammonium acetate dan kembali disimpan di dalam refrigerator pada kondisi yang sama. Supernatan (700 µL) diambil melalui prosedur sentrifus dengan kecepatan penuh selama 5 menit, untuk kemudian dicampur dengan 10% CTAB dan CHISAM (24:1) sebanyak 50 µL dan 700 µL. Setelah disentrifus dengan kecepatan penuh selama 5 menit, 700 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus yang baru berisi 700 µL isopropanol dingin untuk presipitasi selama 30 menit di dalam freezer dan disentrifus selama 20 menit dengan kecepatan penuh. Pellet DNA dicuci dengan 70% etanol absolute, dikeringkan dan dilarutkan kembali dengan larutan  TE. Sebanyak 5 µL DNA bersama-sama dengan 50 ng dan 100 ng Lamda DNA dilewatkan dalam gel agarose 1% untuk mengetahui kuantitas DNA dan kualitas (Sambrook et al., 1989).

Amplifikasi dan Separasi DNA. Amplifikasi sampel DNA apel dengan primer ISSR dilakukan berdasarkan metode Scarano et al. (2002). Program mesin PCR adalah 1 siklus  denaturasi suhu 94°C selama 3 menit, diikuti dengan 28 siklus denaturasi suhu 94°C selama 45 detik, annealing suhu 53°C selama 1 menit, dan extension suhu 72°C selama 2 menit. Siklus PCR untuk primer ISSR ini diakhiri dengan 1 siklus ekstensi akhir suhu 72°C selama 10 menit. Setiap sampel DNA dicampurkan dengan 20 µl mengandung 10 ng DNA genomik sebagai cetakan, 0.25 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP), 0.5 pmol  primer (ISSRA, ISSRB, ISSRC, ISSRD, ISSRE, ISSRF, ISSRG, dan ISSRH), 1 unit enzim Taq DNA polymerase dalam  larutan buffer 1X dan 3mM MgCl2. Pemisahan pita ISSR hasil amplifikasi dilakukan dengan metode elektroforesis pada gel agarose 2% mengandung  Ethidium bromida (10 mg/L)  di dalam larutan 1X TBE selama 1 jam pada kekuatan arus 100 Volt.  Deteksi pita DNA dilakukan dengan biodokumentasi sistem.

Skoring dan Analisis Dendrogram. Skoring pita DNA dilakukan berdasarkan ada dan tidaknya pita DNA pada setiap varietas. Pita-pita DNA yang terbentuk dari hasil analisis molekuler marker dianggap sebagai satu karakter yang mewakili 1 lokus DNA.  Pita-pita DNA dengan laju migrasi yang sama diasumsikan sebagai lokus yang homolog.  Profil DNA tersebut selanjutnya diterjemahkan ke dalam data biner berdasarkan kehadiran pita (1) dan tidak ada pita DNA (O) untuk membangun matrik kemiripan. Pengelompokan varietas di dalam dendrogram dihitung menurut UPGMA dengan menggunakan metode SHAN pada program NTSys-PC versi 2,10.                                            

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sampel DNA plasmanutfah apel telah diisolasi dari teknik ekstraksi DNA skala mikro berdasarkan metode CTAB. Kualitas DNA cukup baik meski mengandung RNA dan terdapat patahan DNA dibeberapa sampel. Kondisi ini disebabkan oleh faktor keterbatasan fasilitas dan tidak ditambahkannya RNAse ke dalam sampel. Kuantitas DNA yang diperoleh berkisar 25-80 ng menurut pendugaan sistem biodokumentasi (Biometra). Gambar 1 memperlihatkan kualitas dan kuantitas DNA plasmanutfah apel dibandingkan dengan kontrol DNA (Promega).

JURNAL HORTI APEL Agus 2007 rev_01
Gambar 1. Kualitas dan kuantitas DNA plasmanutfah apel hasil ekstraksi dengan metode CTAB; 1. Princess Nobel, 2. Rome Beauty, 3. Manalagi, 4. Grany Smith, 5. Mutzu I, 6. Anna, 7. Osako, 8. Huang Lin, 9. Summerdel,  10. Imperial Gala. (The DNA quality and quantity of apple germplasm extracted by CTAB methods).

Sebanyak delapan (8) primer ISSR telah digunakan untuk mengamplifikasi sampel DNA plasma nutfah apel. Primer-primer tersebut mampu mengenali region-region mikrosatelit yang ada pada genom apel pada frekuensi dan kuantitas yang berbeda, dan menunjukkan kondisi keragaman plasmanutfah. Dari delapan primer yang tersedia dan dicobakan untuk mengamplifikasi DNA sampel apel, 3 primer menghasilkan fragmen-fragmen polimorfisme. Sementara 5 primer yang lain menunjukkan monomorfisme dan tidak terjadi amplifikasi. Tabel 1 memperlihatkan keragamanan pita DNA sampel plasmanutfah apel dan kontribusinya terhadap statistika lokus dan alel yang diperoleh.

Tabel 1.  Statistika jumlah lokus (TL),  lokus polimorfis (PL), lokus monomorfis (ML) dan jumlah alel (NA) dari hasil amplifikasi 3 primer ISSR. (Statistical analysis of total locus (TL), polymorphic locus (PL), monomorphic locus (ML), and number of alleles (NA) of amplification product of 3 ISSR primers)

JURNAL HORTI APEL Agus 2007 rev_02.1

JURNAL HORTI APEL Agus 2007 rev_02.2
Gambar 2.  Dendrogram 10 varietas apel berdasarkan primer ISSR A (bawah-kanan), C (bawah-kiri), E (atas-kanan) dan gabungan A dan E (atas-kiri).(Dendrogram of 10 apple varieties revealed by ISSR primers;  A (below-right), C (below-left), E (top-right) and AE (top-left).

Analisis molekular 10 varietas plasmanutfah apel oleh 3 primer ISSR telah menghasilkan 260 alel dimana 139 (53,46%) diantaranya adalah polimofis didalam 29 lokus yang polimorfis. Hasil ini cukup tinggi untuk eksplorasi pita DNA karena 69,05 persen lokus atau pita DNA menunjukkan keragaman di dalam 10 varietas tersebut. Melihat jumlah alel yang diperoleh dari setiap primer, terlihat bahwa penyebaran sekuen AC pada primer ISSR C lebih dominan dibanding AC (ISSR A) meski persentase polimorfismenya lebih rendah. Jumlah lokus yang dapat diobservasi akan lebih banyak dengan variasi keragaman lokus diantara varietas-varietas yang lebih tinggi apabila pemisahan produk amplifikasi dilakukan menggunakan gel beresolusi tinggi dari bahan poliakrilamid.

Dari dendrogram yang dihasilkan terlihat bahwa plasmanutfah apel yang dianalisis memiliki keragaman genetik yang cukup lebar dari 45 hingga 100 persen. Setiap primer yang digunakan menunjukkan pola pengelompokan yang beragam. Primer ISSR A dan E menunjukkan kemiripan berkisar antara 55-88 persen, sementara pada primer ISSR C persentase kemiripan plasmanutfah apel cenderung tinggi dengan perbedaan yang sempit. Berdasarkan primer ISSR C ini Princes Nobel dan Anna, Rome Beauty dan Manalagi secara genetik sama dan berada dalam satu kelompok. Jika analisis difokuskan kepada dendrogram dari gabungan primer A dan E, terlihat bahwa Rome Beauty, Huang Lin dan Manalagi yang berkembang baik di Batu berada dalam satu kelompok dengan kemiripan genetik berkisar 66 persen, sementara Apel Anna terpisah di kelompok yang lain dengan kemiripan sekitar 62 persen. Rome Beauty dan Huang Lin secara genetik berbeda sekitar 28 persen.

Karakterisasi subgenus Malus dan spesiesnya dihadapkan pada kesulitan kedekatan kekerabatan karena telah dibudidayakan pada kurun waktu yang lama secara vegetatif. Penyebarannya yang cukup luas sehingga sulit menentukan asal dan keragamannya akibat campur tangan manusia.  Pengukuran keragaman genetik merupakan tahapan penting untuk membangun hubungan kekerabatan genetik, dan sumber informasi yang penting dalam karakterisasi dan konservasi plasmanutfah untuk keberhasilan pengendalian erosi genetik, mendisain strategi sampling atau koleksi inti, dan menyusun program pemuliaan.

Penanda molekular telah digunakan secara luas diberbagai tanaman untuk menjelaskan hubungan filogenetik, dan bermanfaat pula untuk studi genetik tanaman apel. Penanda DNA atau molekuler semakin penting di dalam program pemuliaan karena stabilitas fenotipnya, kemampuan mendeteksi polimorfisme dan mudah dikembangkan yang memungkinkan penggunaannya dalam membantu pemuliaan (marker-assisted breeding).

Untuk efisiensi pelaksanaan karakterisasi dengan banyaknya tanaman yang harus dianalisis, maka penanda  DNA yang dipilih haruslah murah  dan mudah dihitung. Selain itu, untuk memaksimalkan produksi pita dan eksplorasi polimorfisme, penanda molekuler sebaiknya bersifat umum dan tersebar disepanjang genom dan berbasis PCR. Primer random seperti RAPD dan primer yang mengamplifikasi mikrosatelit atau daerah diantara mikrosatelit sesuai untuk karakterisasi plasmanutfah karena kemampuannya mengeksplorasi genom. ISSR diaplikasi dalam input yang minimal dengan hanya menggunakan gel agorose dan deteksi non-radioaktif. Reaksi PCR dioptimasi dengan hanya memodifikasi protokol standar kondisi PCR termasuk magnesium klorida (MgCl2) dan profil mesin PCR (Cai, et al., 1994).  Bila amplikon PCR ISSR diseparasi dengan gel poliakrilamid, jumlah pita DNA yang dapat dideteksi lebih banyak dibandingkan dengan analisis RAPD (Wolff, et al., 1995). Sebagaimana marker mikrosatelit, amplifikasi ISSR dapat dengan cepat membedakan individu-individu yang berkerabat dekat (Zietkiewicz et al., 1994).

KESIMPULAN

Primer ISSR dapat digunakan untuk membedakan plasmanutfah apel dan mengelompokkannya berdasarkan kesamaan dan perbedaan genetik. Primer ISSR C mendeteksi lebih banyak kemiripan diantara plasmanutfah apel sementara primer ISSR A dan E mendeteksi keragaman yang besar diantara plasmanutfah apel.

 

Sugiyatno, A dan Dita Agisimanto
Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika
Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian

Related Post

Tinggalkan Balasan